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常見送樣問題：

1.血漿（plasma）還是血清(serum)？

對(duì)于大多數(shù)涉及到Exosome RNA分離的研究，我們推薦使用血漿（plasma）。因?yàn)檠迨占笤谀^程中，血小板受到刺激會(huì)產(chǎn)生許多Exosome和其他形式的小泡，因此血清中獲得的小泡始終比血漿中多，甚至超過50%的小泡來源于血小板。所以血漿是研究病理生理狀態(tài)下Exosome更好的介質(zhì)。多數(shù)的criculating Exosome研究樣本使用的是血漿。負(fù)壓采血之后，血液首先存放入采血管，去除止血帶，最初的幾毫升不要，因?yàn)橛袎毫せ钚?yīng)，并且被成纖維細(xì)胞污染。血液收集應(yīng)該輕柔并且迅速。顛倒混勻采血管8-10次，與管壁上的抗凝劑混合，但不要為了抗凝而劇烈搖動(dòng)。離心前管子應(yīng)該垂直存放，并記錄實(shí)驗(yàn)室中存放的時(shí)間，因?yàn)閺牟裳诫x心除去細(xì)胞和血小板這中間的過程很重要，建議在30min內(nèi)完成，長(zhǎng)時(shí)間的存放，而沒有及時(shí)處理會(huì)導(dǎo)致血小板細(xì)胞Exosome的進(jìn)一步釋放。血液要盡快處理，在室溫條件下分離血漿（或者血清）。所有樣品要使用相同的轉(zhuǎn)速和轉(zhuǎn)子類型離心。

2.怎樣選擇抗凝劑（anticoagulant）？

抗凝劑有一個(gè)或多個(gè)形式的功能,包括螯合鈣、蛋白酶抑制和抑制血小板活化。有許多抗凝血?jiǎng)┛捎茫唤ㄗh使用肝素（heparin）抗凝劑。無論是外源性或內(nèi)源性起源（例如肥大細(xì)胞），肝素會(huì)抑制下游PCR反應(yīng)，因?yàn)楦嗡貢?huì)與引物和酶競(jìng)爭(zhēng)與核酸結(jié)合。另外,肝素可抑制Exosome與靶細(xì)胞的結(jié)合,抑制Exosome激活血小板或降低血小板激活閾值。應(yīng)用肝素治療的病人也應(yīng)該注意。 對(duì)于珍貴樣本，可能需要從肝素化的血液樣品中提取RNA。核酸的檢測(cè)需要通過調(diào)整PCR的敏感性。另外如果Exosome相關(guān)核酸被發(fā)現(xiàn)只存在于Exosome內(nèi),在RNA分離之前的洗滌也可以幫助去除肝素。其它抗凝劑如EDTA、氟化鈉/草酸鉀(NaF/KOx),或檸檬酸三鈉[加入/不加右旋糖dextrose(ACD)或茶堿(theophylline)、腺苷(adenosine)和雙嘧達(dá)莫(CTAD)]就更復(fù)雜了，最好根據(jù)下游的實(shí)驗(yàn)來指導(dǎo)。CTAD阻礙血小板活化和隨后的Exosome釋放。EDTA可干擾PCR反應(yīng)(盡管程度低于肝素),但它的存在可能是無害的。另外,下游實(shí)驗(yàn)的選擇需要考慮到抗凝劑的使用種類。不同的聚合酶對(duì)抑制劑有不同的敏感性。

3.靜脈取血過程應(yīng)該注意什么?

在血液處理過程中，由于物理作用力，血小板中的Exosome容易在處理過程中釋放，這些外力包括：接觸、壓力、剪切力，所以標(biāo)準(zhǔn)化的樣品處理，需要統(tǒng)一的注射器型號(hào)以及其他操作。使用21號(hào)針頭或者更大號(hào)的針頭可以避免靜脈取血剪切力引起的不良效應(yīng)。負(fù)壓采血之后，血液首先存放入采血管，去除止血帶，最初的幾毫升不要，因?yàn)橛袎毫せ钚?yīng)，并且被成纖維細(xì)胞污染。血液收集應(yīng)該輕柔并且迅速顛倒混勻采血管8-10次，與管壁上的抗凝劑混合，但不要為了抗凝而劇烈搖動(dòng)。

4.樣本受晝夜節(jié)律，采血時(shí)間和飲食狀態(tài)的影響嗎？

血液學(xué)參數(shù)在人體的一天之中是有變化的，血液粘稠度的輕微變化在幾十年前就已發(fā)現(xiàn)。最近發(fā)現(xiàn)，晝夜節(jié)律對(duì)于血小板的激活具有很大的影響，而且比壓力（包括鍛煉身體）的影響還要大。 白細(xì)胞穿梭以及在促炎癥因子和抗炎癥因子在血液循環(huán)中存在也在一天當(dāng)中有變化。因此，對(duì)于Exosome的研究，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上，需要有嚴(yán)格的對(duì)照，采血時(shí)間在晝夜節(jié)律上的一致才能更容易的比較樣本差異。此外，還需要考慮，樣本來源人體在正常睡眠/蘇醒周期上的差異性。食物對(duì)于Exosome的影響目前還不知道，但是因?yàn)橹鞍纵d著RNA，食物的吸收影響血液循環(huán)中脂蛋白顆粒的類型、數(shù)量和功能，因此采血可以在飯后一個(gè)統(tǒng)一的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行，進(jìn)食記錄也是很有價(jià)值的。

5.還需要額外的數(shù)據(jù)收集嗎?

來自血液其他數(shù)據(jù)對(duì)于分析病理生理作用也是很有意義的，有時(shí)可能還需要分離其它細(xì)胞如白細(xì)胞或者血清游離DNA/RNA作為Exosome的對(duì)照，有時(shí)需要流式細(xì)胞術(shù)配合抗體對(duì)細(xì)胞分選或分析，確定血液細(xì)胞組分的比例。血中Exosome可能來自其他組織器官，有時(shí)需要從同一個(gè)患者身上得到多種體液與血液進(jìn)行對(duì)比，例如腦脊液(CSF)和血漿樣本。

6.溶血是否影響結(jié)果？

一般溶血樣本通過顏色就可以看出來，如果必要可通過分光光度計(jì)和血紅蛋白釋放實(shí)驗(yàn)測(cè)量。當(dāng)分析總exRNA，溶血的血液制品含有高濃度的特定RNA，其中包括miR-16和miR-451等，還有待確定RNA以這種方式釋放是否會(huì)干擾exRNA分析結(jié)果。

7.血液樣本需要記錄哪些信息？

國際細(xì)胞外囊泡學(xué)會(huì)(International Society for Extracellular Vesicles, ISEV)推薦記錄如下信息：

采血時(shí)間

采血針的類型/其他配件

抗凝管的類型

起始棄去的血液有多少？止血帶是否移除迅速？

采血時(shí)間和離心時(shí)間間隔有多久？

處理注意事項(xiàng)（樣本是否保持垂直？是否室溫存放？）

是否溶血和檢測(cè)方法？

樣本處理細(xì)節(jié)（轉(zhuǎn)子類型、離心力、離心時(shí)間）

樣本分裝細(xì)節(jié)和存放

細(xì)胞是否分離？

全血計(jì)數(shù)？

流式檢測(cè)？

是否還進(jìn)行其他血液檢測(cè)？

是否有匹配的其他樣本收集（比如血漿和血清，尿液，鼻液，口水等）

是否有病人親屬樣本作為對(duì)照