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      人們對外泌體的診斷和治療潛力越來越感興趣，但是對這些細(xì)胞外囊泡的確切描述仍然是未知的。針對這個(gè)問題，來自美國范德堡大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的Robert J. Coffey課題組在近期的Cell雜志上發(fā)表文章，根據(jù)嚴(yán)格的分離方法對外泌體進(jìn)行了重新評估，挑戰(zhàn)了這些細(xì)胞間通信載體的一些公認(rèn)特性。

      細(xì)胞釋放不同大小、不同細(xì)胞內(nèi)起源的胞外小泡（EVs）。EVs的異質(zhì)性和非囊泡性細(xì)胞外納米顆粒的存在對我們理解不同分泌成分的組成和功能特性構(gòu)成了主要障礙。更精確地了解RNA、DNA和蛋白質(zhì)所在的正確細(xì)胞外組分，并確定它們的分泌機(jī)制，對于識別生物標(biāo)志物和設(shè)計(jì)未來的藥物干預(yù)至關(guān)重要。

     外泌體是由內(nèi)體衍生的40-150納米的小細(xì)胞外囊泡(sEVs)，由大多數(shù)細(xì)胞分泌。RNA（包括mRNA、microRNA [miRNA]和其他非編碼RNA）、DNA和脂質(zhì)被報(bào)道積極和選擇性地整合到腔內(nèi)小泡(ILVs)中，這些小泡位于多泡內(nèi)體(MVEs)中，是外泌體的前體。除了形成外泌體中膜蛋白的組分，內(nèi)體膜的向內(nèi)出芽被認(rèn)為會導(dǎo)致胞質(zhì)蛋白和其他成分被吞噬到ILVs的腔內(nèi)的機(jī)制。MVEs與質(zhì)膜融合后，將ILVs作為外泌體釋放到細(xì)胞外空間。相比之下，微泡是由質(zhì)膜脫落產(chǎn)生的150-1000 nm的大細(xì)胞外膜泡（lEVs）。然而，至今仍然缺乏區(qū)分微泡和外泌體的特異性標(biāo)記物。

      最近人們對EVs的興趣越來越大，主要是由于發(fā)現(xiàn)外泌體在分泌的細(xì)胞外RNA (exRNA)的轉(zhuǎn)運(yùn)中起作用，包括細(xì)胞外miRNA和mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)。Argonautes (Agos)是重要的miRNA加工蛋白，外泌體介導(dǎo)Ago蛋白分泌仍是一個(gè)懸而未決的問題。其他RNA結(jié)合蛋白(RBPs)也被報(bào)道存在于外泌體中，可能具有RNA分選的作用。然而，細(xì)胞外囊泡和納米顆粒的異質(zhì)性，以及純化策略的差異，使當(dāng)前外泌體的分析變得混亂。

      來自范德堡大學(xué)的研究人員近期在Cell雜志上發(fā)表文章，對外泌體組成進(jìn)行了重新評估，確定了蛋白質(zhì)、RNA和DNA在小細(xì)胞外囊泡和非囊泡細(xì)胞外物質(zhì)之間的差異分布，并確定小細(xì)胞外囊泡不是活躍的DNA釋放載體。

      傳統(tǒng)外泌體分離方法和該研究改善的外泌體分離方法的對比

     (A) 傳統(tǒng)的外泌體分離方法產(chǎn)生了富含外泌體且無大細(xì)胞外囊泡(lEVs)的囊泡和非囊泡的混合物。

     (B) 該報(bào)道改善的外泌體分離方法采用兩步法，首先使用高分辨率密度梯度離心從小細(xì)胞外囊泡(sEVs)中分離出非囊泡部分，然后通過直接免疫親和捕獲(DIC)從非外泌體sEVs中分離出真正的經(jīng)典外泌體。經(jīng)典外泌體由四次跨膜蛋白CD9、CD63和CD81的表達(dá)標(biāo)記，而非外泌體sEVs由annexins A1和A2標(biāo)記。

      該研究采用高分辨率密度梯度分離技術(shù)將sEVs從非囊泡性顆粒中分離出來，并采用直接免疫親和捕獲技術(shù)（direct immunoaffinity capture, DIC）將外泌體從其他類型的sEVs中分離出來。DIC在無超離的情況下，以經(jīng)典的外泌體四次跨膜蛋白為靶點(diǎn)，采用捕獲珠進(jìn)行分離。蛋白質(zhì)組學(xué)和核酸分析表明，細(xì)胞外RNA和蛋白質(zhì)在sEVs和非囊泡組分中有不同的表達(dá)。包括Ago1-4在內(nèi)的許多與外泌體裝載exRNA相關(guān)的RBPs與帶有外泌體標(biāo)記蛋白CD63、CD81和CD9的經(jīng)典外泌體無關(guān)。外泌體缺乏細(xì)胞骨架元素和常見的糖酵解酶；這些高度豐富的胞質(zhì)蛋白的缺乏表明外泌體的裝載一定是一個(gè)高度調(diào)控的過程。這些研究是使用人類結(jié)腸癌(DKO-1)和膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Gli36)癌細(xì)胞系進(jìn)行的。這一主要發(fā)現(xiàn)在正常人類腎上皮細(xì)胞和血漿中得到了證實(shí)。

DKO-1細(xì)胞分泌的大細(xì)胞外囊泡（lEV）、小細(xì)胞外囊泡（sEV）和非囊泡組分的電鏡圖

     人們一直認(rèn)為外泌體是細(xì)胞外DNA分泌的載體，使它們成為癌癥患者液體活檢的誘人目標(biāo)。該研究提供的證據(jù)表明，雙鏈DNA (dsDNA)和DNA結(jié)合組蛋白不存在于外泌體或任何其他類型的sEV中。相反，該研究證明細(xì)胞外dsDNA和組蛋白的活躍分泌是通過自噬和MVE依賴的機(jī)制發(fā)生的，而不依賴于外泌體。此外，該研究確定annexin A1是經(jīng)典質(zhì)膜形成的微泡的一個(gè)標(biāo)志蛋白。這些發(fā)現(xiàn)更精確地闡明了外泌體成分，為探索其功能特性提供了更堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

      細(xì)胞外dsDNA和組蛋白的分泌不依賴于外泌體和小細(xì)胞外囊泡

      該研究表明，真正的外泌體在生物分子成分方面的范圍要比人們普遍接受的小得多。雖然外泌體的分類標(biāo)準(zhǔn)本質(zhì)上不是非常的精準(zhǔn)的，但科學(xué)命名法的精確性對于確保實(shí)驗(yàn)觀察之間的一致性至關(guān)重要。正確地將功能定位到適當(dāng)?shù)募?xì)胞外實(shí)體將是其作為生物標(biāo)志物或治療手段成功應(yīng)用的必要條件。

參考文獻(xiàn)：

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Pluchino S, Smith JA. Explicating Exosomes: Reclassifying the Rising Stars of Intercellular Communication. Cell. 2019 Apr 4;177(2):225-227. doi: 10.1016/j.cell.2019.03.020.