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一管血檢測癌癥，是全球醫(yī)學(xué)界共同的夢想。液體活檢作為傳統(tǒng)活檢的替代技術(shù)，通過非侵入性的取樣方式獲得腫瘤信息，輔助癌癥治療，是精準(zhǔn)醫(yī)療代表性的診斷技術(shù)。液體活檢的主要檢測物包括血液中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells，CTCs)、循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)和外泌體(exosomes)。作為液體活檢領(lǐng)域的"三駕馬車"之一，外泌體是細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要載體，具有豐富的可檢測靶標(biāo)(蛋白、DNA、RNA、脂質(zhì)等)。雖然有大量的證據(jù)表明外泌體及其內(nèi)容物具有成為新型診斷標(biāo)志物的潛能，但其進(jìn)入臨床仍面臨很多障礙。

外泌體檢測的興起

1986年，Johnstone等在體外培養(yǎng)的綿羊紅細(xì)胞培養(yǎng)液上清中發(fā)現(xiàn)外泌體，1996年Raposo等發(fā)現(xiàn)B淋巴細(xì)胞分泌的外泌體攜帶MHC-Ⅱ類分子、共刺激因子和黏附因子。2007年Lotvall和Valadi發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞之間可以通過外泌體中的RNA來交換遺傳物質(zhì)。

2013年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎授予從事細(xì)胞內(nèi)囊泡(外泌體)運(yùn)輸調(diào)控機(jī)制研究的3位科學(xué)家，James E. Rothman、Randy W. Schekman和Thomas C. Südhof，由此將外泌體研究推向了前所未有的新高潮。2015年6月24日美國德克薩斯大學(xué)安德森癌癥中心研究團(tuán)隊(duì)通過大量胰腺癌患者血清標(biāo)本分析發(fā)現(xiàn)，早期胰腺癌患者血清中GPC1(glypican-1)陽性的外泌體豐度顯著高于正常人群及慢性胰腺炎患者，可以作為一種非侵入性診斷和篩查處于適合手術(shù)治療階段的早期胰腺癌的標(biāo)志物。

2016年1月，Exosome Diagnostics公司推出世界首款癌癥外泌體診斷產(chǎn)品ExoDx Lung(ALK)，實(shí)時檢測非小細(xì)胞肺癌患者EML4-ALK突變，公司官方公布的檢測診斷敏感度為88%，特異度為100%。此后該公司相繼推出肺癌外泌體檢測產(chǎn)品ExoDx LungT(790M)、ExoDx Lung(EGFR)，前列腺癌的尿液外泌體活檢產(chǎn)品ExoDx?Prostate。癌癥診斷領(lǐng)域之外，越來越多的公司參與到了研發(fā)基于外泌體為基礎(chǔ)的診斷產(chǎn)品研發(fā)中，以Exosome Science公司為代表，陸續(xù)發(fā)布外泌體生物標(biāo)志物診斷、監(jiān)測阿爾茨海默病、慢性創(chuàng)傷性腦病和其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究數(shù)據(jù)。

外泌體在短短30多年的研究歷程中，從基礎(chǔ)研究走到了臨床應(yīng)用，成為液體"火"檢三大標(biāo)桿之一，與此同時外泌體也成為了資本市場追逐的焦點(diǎn)。Codiak BioSciences公司自2015年成立以來，募集總額達(dá)1.685億美元。韓國外泌體干細(xì)胞治療公司ExoCoBio，成立后4個月內(nèi)A輪融資1 100萬美元，成為韓國規(guī)模最大、投資最快的投資項(xiàng)目。國外已有多家公司推出外泌體分離試劑盒，國內(nèi)也有多家從事外泌體檢測服務(wù)的企業(yè)，分散分布于以液體活檢公司為基本框架奠定的市場產(chǎn)業(yè)鏈中，包括：研究上游外泌體的提取、鑒定，試劑儀器供應(yīng)市場；中游外泌體核酸擴(kuò)增、蛋白質(zhì)譜檢測服務(wù)市場；下游數(shù)據(jù)分析市場。

雖然作為新型液體活檢標(biāo)志物，"新寵"外泌體被炒得火熱，但仍需理性期待這一技術(shù)的應(yīng)用。至少目前為止，幾乎所有外泌體診斷產(chǎn)品都處于實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的測試階段，鮮有走出科研進(jìn)入臨床應(yīng)用的。

面臨的挑戰(zhàn)

(一)外泌體分離鑒定

建立快速、低成本、高純度的外泌體捕獲、鑒定、定量方法體系是外泌體進(jìn)入臨床檢驗(yàn)的前提。目前最常用的外泌體分離富集方法為超高速離心法、聚合沉淀法、免疫親和法、超濾法和凝膠排阻層析法。

目前有多種商品化外泌體分離試劑盒，包括基于聚合沉淀法的ExoQuick?(美國System Biosciences公司)、Total Exosome Isolation Reagent (美國Invitrogen公司)；基于免疫磁珠親和法的Exosome-Human CD9/CD81/CD63/CD81/EpCAM(美國Invitrogen公司)、Isolation Reagent Mag Capture? Exosome Isolation Kit PS(日本W(wǎng)ako公司)；基于超濾法exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit (德國QIAGEN公司)等。

商品化試劑盒多采用聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)為多聚物的沉淀法、超濾法和免疫學(xué)方法分離外泌體。沉淀法以SBI公司生產(chǎn)的ExoQuick?(美國System Biosciences公司)試劑盒為代表，操作簡便，不需要額外的設(shè)備。然而PEG沉淀會夾雜分離大量雜質(zhì)(蛋白、脂類等)，此外，存在于分離物中的聚合物也可能會干擾下游分析。免疫法利用包被單克隆抗體的磁珠結(jié)合外泌體，可保證外泌體形態(tài)的完整，特異性高。使用抗腫瘤相關(guān)的HER2和EpCAM抗體可以分離出腫瘤特異性外泌體。然而，免疫沉淀需要特異性抗體，檢測成本高，且僅能捕獲表達(dá)特定抗原的目標(biāo)外泌體，漏檢率高。離心法是科研提取外泌體最常用的方法，但所需樣本量大、耗時、回收率低(5%～25%)；凝膠排阻層析可以分開雜質(zhì)獲得高純度外泌體，但受處理樣本體積限制。微流控芯片集外泌體分離與檢測為一體，但需要填充管道，損失外泌體檢測體積。目前各類外泌體分離方法僅用于科學(xué)研究，遠(yuǎn)不能達(dá)到臨床檢測要求。

分離后的外泌體可通過多種電子顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)檢測，如掃描電鏡、透射電鏡、冷凍電鏡及原子力顯微鏡，目前研究文獻(xiàn)中使用最多的為透射電鏡；采用免疫印跡、流式細(xì)胞術(shù)等技術(shù)鑒定特異性表面蛋白標(biāo)志物。外泌體是由細(xì)胞內(nèi)多囊泡體與細(xì)胞脂膜融合后向細(xì)胞外分泌的囊泡，因此存在脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，包括跨膜蛋白、細(xì)胞內(nèi)源性蛋白、膜表面蛋白等(圖1)。不同細(xì)胞來源外泌體蛋白成分存在差異。國際細(xì)胞外囊泡學(xué)會發(fā)布"證明樣品中存在外泌體的最低實(shí)驗(yàn)要求"指導(dǎo)性文件中提出，采用蛋白標(biāo)志物鑒定外泌體時，應(yīng)同時檢測到所分離樣品中至少存在1個跨膜蛋白(如四次跨膜蛋白CD9、CD63，黏附分子等)、1個細(xì)胞內(nèi)源性蛋白，如腫瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101，TSGl01)、膜聯(lián)蛋白A(annexin A，ANXA)、Rab家族蛋白(Ras-related protein Rab，Rab)，而不存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來源蛋白，如鈣聯(lián)接蛋白(calnexin, CANX)、高爾基體基質(zhì)蛋白(Golgi matrix protein，GM130) 或核蛋白。

▲圖1 外泌體結(jié)構(gòu)示意圖

當(dāng)下外泌體研究中最棘手的問題之一是如何準(zhǔn)確測量評估外泌體純度。滿足檢測需求的外泌體純度，是后續(xù)內(nèi)容物檢測的前提。目前有兩種從不同維度衡量外泌體濃度的指標(biāo)：(1)外泌體蛋白濃度；(2)外泌體顆粒數(shù)。外泌體蛋白濃度通常使用二喹啉甲酸微量蛋白濃度試劑盒測定，外泌體顆粒數(shù)測量方法包括光學(xué)方法如納米顆粒跟蹤分析，動態(tài)光散射和流式細(xì)胞術(shù)，以及非光學(xué)方法，如電阻式脈沖傳感，透射電子顯微鏡和拉曼光譜。目前尚不能通過單一方法準(zhǔn)確定量外泌體純度和濃度，未來的檢測趨勢是計(jì)算囊泡比率濃度(即"蛋白質(zhì)與顆粒"比率)。

(二)外泌體成分檢測

外泌體中含有多種核酸以及蛋白類等物質(zhì)，可從不同角度監(jiān)測腫瘤的進(jìn)展與轉(zhuǎn)歸預(yù)后等的關(guān)系。每毫升血液中僅有1～10個CTC，而每毫升血液含有1×109個外泌體，含量極高。外泌體的脂膜結(jié)構(gòu)對所包含的核酸分子起到良好的保護(hù)作用，具有更高的穩(wěn)定性。外泌體的粒徑較小，通透性強(qiáng)，容易到達(dá)各種體液中，是液體活檢的前提條件；此外所有細(xì)胞都能分泌外泌體，包括腫瘤細(xì)胞及相關(guān)的免疫細(xì)胞，故能反映腫瘤微環(huán)境等多種信息。外泌體分離鑒定后，根據(jù)檢測需求選取不同下游技術(shù)檢測外泌體表面標(biāo)記物或內(nèi)容物，包括流式細(xì)胞術(shù)、質(zhì)譜或二代測序等。那么何種成分檢測最有可能在臨床檢驗(yàn)開展？

外泌體胞漿來源的屬性決定其DNA含量很少，缺乏DNA檢測信息。檢測技術(shù)層面來說，蛋白不能擴(kuò)增，很多重要的低豐度蛋白無法通過現(xiàn)有檢測手段檢出，蛋白檢測需要寄希望于高敏感檢測方法研發(fā)。外泌體內(nèi)RNA可以進(jìn)行擴(kuò)增，目前外泌體RNA研究主要有兩個方向，一種是利用測序技術(shù)直接獲取RNA序列信息，另一種則是利用RNA擴(kuò)增技術(shù)檢測包含特定序列RNA濃度。前一種需要將特定序列捕獲，分離純化再進(jìn)行測序，高通量測序技術(shù)可發(fā)現(xiàn)新的突變，但費(fèi)用較高且檢測時間略長；擴(kuò)增子測序則使用特定的引物對樣品進(jìn)行多級PCR后純化獲得特定序列進(jìn)行測序，臨床應(yīng)用簡便易行，可動態(tài)監(jiān)測突變位點(diǎn)，但需要提前了解腫瘤基因的突變信息。受益于測序技術(shù)的發(fā)展，RNA可能是有望最早成熟的外泌體成分檢測技術(shù)。

然而，不管是外泌體核酸檢測還是蛋白檢測，最終都需要對數(shù)據(jù)進(jìn)行深度分析處理以及解讀?，F(xiàn)階段國內(nèi)生物信息挖掘平臺和人才，大多儲備于商業(yè)性的基因組學(xué)服務(wù)企業(yè)。從短期來看外泌體測序檢測只能服務(wù)于少部分經(jīng)濟(jì)條件允許的患者，而作為臨床常規(guī)檢測項(xiàng)目開展需要多學(xué)科的協(xié)同發(fā)展。

(三)檢測質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)

將外泌體研究成果轉(zhuǎn)化為臨床應(yīng)用面臨的關(guān)鍵障礙是缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的技術(shù)規(guī)范，包括檢測前(標(biāo)本選擇問題)，檢測中(檢測方法及鑒定統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)問題，不同的內(nèi)容物分析，不同檢測手段)及檢測后的每一個環(huán)節(jié)。

分析前質(zhì)量控制，雖然處在檢測標(biāo)本進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室之前的環(huán)節(jié)，但卻恰恰是最重要的環(huán)節(jié)。有明確證據(jù)表明血漿是外泌體分析最佳血液標(biāo)本類型，樣本收集應(yīng)使用細(xì)胞穩(wěn)定管或EDTA抗凝血管。但其他可能影響外泌體檢測的分析前多種變量，如樣本收集、樣本處理、儲存條件和時間以及與患者有關(guān)的生物因素等，仍不明確，需要進(jìn)一步研究。

任何臨床檢測需要以檢測方法的有效性為前提，尤其要注意接近檢測下限的結(jié)果。較為理想的情況是能夠有標(biāo)準(zhǔn)化的樣品作為比較，然而目前外泌體標(biāo)準(zhǔn)品領(lǐng)域幾乎為空白，幾乎所有外泌體診斷研究均采用自建檢測方法、自建檢測區(qū)間。

高靈敏度和高特異性的檢測一直是臨床檢驗(yàn)所期待的。外泌體因其獨(dú)特的形成機(jī)制，豐富穩(wěn)定的內(nèi)容物，被譽(yù)為目前最理想的液體活檢分析材料。然而高靈敏度的檢測需要嚴(yán)格控制才能避免假陽性。由于缺乏統(tǒng)一的檢測方法和標(biāo)準(zhǔn)，目前已公布外泌體研究結(jié)果的有效性、可重復(fù)性以及結(jié)果的通用性依然存疑。現(xiàn)階段不同研究實(shí)驗(yàn)室使用的方法各異，檢測的具體細(xì)節(jié)不同，不同外泌體檢測可能無法給出相同的結(jié)果，研究結(jié)果具有不可比性。除已獲批準(zhǔn)的檢測外，大多數(shù)外泌體檢測方法的臨床有效性和實(shí)用性缺乏相應(yīng)的證據(jù)，尚需進(jìn)一步研究。目前還沒有確切的臨床證據(jù)表明外泌體檢測在臨床試驗(yàn)之外能夠用于腫瘤療效監(jiān)測、早期診斷或篩查。檢測結(jié)果可比性、穩(wěn)定性、有效性未明是外泌體檢測進(jìn)入常規(guī)臨床的主要障礙。

外泌體檢測的應(yīng)用前景

外泌體檢測是一項(xiàng)富有挑戰(zhàn)性的新技術(shù)，在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中扮演著越來越重要的角色。隨著精準(zhǔn)醫(yī)療納入國家"十三五"規(guī)劃，國家科技部決定在2030年前投入600億用于發(fā)展精準(zhǔn)醫(yī)療，國家衛(wèi)生計(jì)生委也發(fā)布了一系列腫瘤診斷和高通量測序相關(guān)的文件和指南。外泌體相關(guān)研究定會乘著國家精準(zhǔn)醫(yī)療戰(zhàn)略的東風(fēng)，實(shí)現(xiàn)長遠(yuǎn)發(fā)展。外泌體聯(lián)合新一代測序技術(shù)、質(zhì)譜分析技術(shù)將有望實(shí)現(xiàn)：疾病的早期篩查、實(shí)時監(jiān)控、治療反應(yīng)監(jiān)控、預(yù)后判斷。此外，外泌體的診斷價(jià)值將更多展現(xiàn)在與CTC、ctDNA、傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物的綜合應(yīng)用，充分結(jié)合ctDNA高靈敏度，CTC高特異性，實(shí)現(xiàn)疾病診斷全息化。未來，液態(tài)活檢各種方式的聯(lián)合使用將是大趨勢。

目前外泌體檢測還處在早期發(fā)展階段，尚未開展多中心、大樣本的基礎(chǔ)以及臨床研究，缺乏有價(jià)值的科研資料指導(dǎo)臨床。外泌體檢測真正進(jìn)入臨床，需要提高檢測技術(shù)的靈敏度和特異性；實(shí)現(xiàn)血液采集系統(tǒng)和分析步驟等的標(biāo)準(zhǔn)化；通過多中心臨床試驗(yàn)驗(yàn)證檢測的臨床效果。外泌體研究發(fā)展之路需要突破技術(shù)瓶頸、需要政策扶持，更需要符合倫理、合理引導(dǎo)、限定范圍的有效監(jiān)管。但隨著廣大科研工作人員的堅(jiān)持不懈的探索和研究，新技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，分離檢測流程的不斷優(yōu)化，外泌體必將會成為精準(zhǔn)醫(yī)療疾病診斷領(lǐng)域的一塊重要陣地。